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质粒DNA提取.

质粒DNA提取常见问题

通常有多种因素会影响质粒DNA的产量,包括菌种、质粒、培养条件、操作等等。

1. 提取无法获得质粒DNA

可能存在的原因如下:

(1)培养的细菌没有转化相应的质粒DNA或细菌培养条件不正确

建议:挑选含有转化质粒DNA的细菌进行培养,并确认细菌培养条件。

(2)细菌保存时间过长

细菌在甘油冻存液中保存时间较长,出现质粒丢失的现象

建议:重新划平板,挑取含质粒的单菌落或重新转化细菌

(3)细菌制备时间过长

建议:使用新制备的细菌提取质粒DNA,

(4)Solution III出现沉淀。

建议:将Solution III置于37℃溶解,混匀后再使用。

(5)Buffer WB没有添加无水乙醇

建议:确认Buffer WB中添加正确体积的无水乙醇。

(6)细菌裂解不充分

建议:离心收集的菌体在加入Solution I后彻底重悬,可以使用移液器反复吹打或涡旋仪彻底打散菌体,而采用2ml离心管也有助于细菌重悬。

(7)洗脱液没有正确滴加到硅胶膜上

建议:将洗脱液滴加到膜的正中间,并在室温放置2分钟增加洗脱效率。

2. 提取质粒DNA得率低

可能存在的原因如下:

(1)菌株本身问题

建议:使用实验室常用大肠杆菌菌株并确认其培养条件。

(2)低拷贝质粒(复制严谨型质粒)

建议:适量增加菌液制备量可一定程度上提高低拷贝质粒DNA的提取量。

(3)细菌重悬不彻底

建议:离心收集的菌体在加入SolutionI后彻底重悬,可以使用移液器反复吹打或涡旋仪彻底打散菌体,而采用2ml离心管也有助于细菌重悬。

(4) Solution III出现沉淀。

建议:将Solution III置于37℃溶解,混匀后再使用。

(5)细菌保存时间过长

建议:使用新制备的细菌提取质粒DNA。

(6)洗脱液问题

建议:请使用Buffer EB进行洗脱,而如使用dd水或其他洗脱液,确认洗脱液的pH值在7-8.5之间。

(7)洗脱液滴加方法不正确

建议:将洗脱液滴加到膜的正中间,并在室温放置2分钟增加洗脱效率。

(8)洗脱液液体积太少

建议:请按说明书上要求使用洗脱液进洗脱,最少不到低于50 ul。

3. 提取获得质粒DNA纯度低

质粒纯度低会导致下游实验的失败或效果差,如:质粒酶切不开,PCR得不到目的基因片段等。

可能存在的原因如下:

(1)基因组DNA污染

a. 细菌培养时间过长或细菌生长过度,部分细菌裂解释放基因组DNA,并降解。

建议:细菌培养时间控制在16-20hr,

b. 加入Solution II后剧烈震荡。

建议:加入SolutionII后轻柔颠倒混匀。不可剧烈震荡或使用涡旋仪。

c. 加入Solution III后立即剧烈震荡。

建议:加入Solution III后上下颠倒混匀。不可剧烈震荡或使用涡旋仪。

d. 裂解时间过长

建议:Solution II加入后立即混匀,裂解时间不要超过5分钟。

(2)杂蛋白污染、RNA污染

a. 在加入SolutionIII后,过柱上清液中含有细小沉淀,未使用Buffer NP洗涤纯化柱。

建议:在上清液过柱时尽量保证上清液中无沉淀。

(3)杂质离子污染

a. 省略了Buffer WB洗脱纯化柱,导致残留的离子污染.

建议:务必按说明书使用Buffer WB洗涤,以尽量去除残留的离子。

(5)乙醇残留

a. Buffer WB洗涤纯化柱后没有进行空管离心操作。

建议:按说明书进行正确的空管离心操作。

(6)其他质粒DNA污染

a. 可能是转化质粒菌株被其他杂菌污染。

建议:尽量挑取单克隆细菌进行培养;细菌接种时在无菌环境中进行。

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