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凝胶回收及PCR产物纯化.

凝胶回收及PCR产物纯化常见问题

Wolact品牌把凝胶回收与PCR产物纯化两大需求在一个产品上实现。

1. 能否从琼脂糖凝胶中回收单链DNA(ssDNA)片段?

答:可以。

2. 可以减少洗脱时buffer EB的用量吗?

答:洗脱时buffer EB用量以30-50ul为宜。洗脱体积小于30ul时,会有少部分洗脱液残留在硅胶膜上,导致回收总量降低。

3. 可以用去离子水进行洗脱吗?

答:可以,注意pH应为7-8.5。但以去离子水洗脱后DNA的产量会低于Buffer EB洗脱的DNA产量。

4. 为什么回收不到DNA片段或回收效率低?

通常会有很多因素影响胶回收或PCR产物的效率,比如:电泳液种类(TAE/TBE)、DNA片段初始量、凝胶块的溶解程度,PCR体系中DNA的含量,洗脱体积等。

常见原因分析:
(1) 电泳缓冲液存放时间过久
建议:胶回收前,更换新电泳缓冲液进行电泳。
(2)切胶的时候没有将目的DNA条带切下
建议:确认切下的胶块中包含有目的DNA,尽量将所有的目的DNA都包含在切下的凝胶中以便获得较高的回收效率。
(3)溶胶液加入比例不合适
建议:正确称量切下琼脂糖凝胶块的重量,按说明书指示,加入正确体积的溶胶液。
(4)凝胶块溶解不充分
建议:溶胶时每间隔2-3min震荡混匀,确保胶块完全溶解。DNA片段会残留在任何没有溶解的胶块中
(5)切下胶块过大。(>200mg)
建议:单个离心柱最多能从200mg凝胶中回收到70-80%的目的片段。若切下胶块超过200mg,需使用多个离心柱进行回收
(6)BufFer WB中忘记添加无水乙醇
建议:参照说明书或试剂瓶上的标签在buffer WB中加入正确体积的无水乙醇并混匀。
(7)洗脱液添加不正确
建议:确认buffer EB或者dd水滴加到了纯化柱膜中间位置;尤其是进行小体积洗脱的时候,一定要确定洗脱液滴加的位置是否正确,否则会导致无法回收到DNA。

5. 为什么回收的DNA影响下游实验?

(1)洗脱下来的DNA片段中盐离子浓度过高
建议:加入buffer WB后,室温放置5分钟再离心,以便能彻底去除盐离子。
(2) 洗脱下来的DNA片段中有乙醇残留
建议:bufer WB洗涤纯化柱后,12000转离心2分钟一定不能省略;如果还有乙醇残留可以将纯化柱在室温放置2-5分钟再进行洗脱。
(3) 洗脱液中含有琼脂糖污染
建议:胶块没有完全溶解,如凝胶块比较大,可以先将胶切成小块,并适当延长溶解时间。

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