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组织、细胞基因组DNA提取.

组织、细胞基因组DNA提取常见问题

通常多种因素会影响基因组DNA产量,包括样本来源,样本保存条件,样本的预处理操作等。

1. 提取过程中无法获得基因组DNA

可能存在的原因如下:

(1)组织样本保存不当或保存时间太长,导致基因组DNA已经降解。

建议:组织样本保存于液氮或者-70℃;尽量使用新近采集样本进行基因组DNA的提取。

(2)样本用量过少可能导致提取不到相应的基因组DNA。

建议:对于保存时间很长或基因组DNA降解比较严重的组织样本,可以适当增加组织样本的用量,以便提取获得满意的基因组DNA。可以根据DNA的需要来确定样本的用量,但是初始样本不宜超过50mg。

(3)鼠尾没有进行剪碎处理

建议:鼠尾较难消化,尽量将鼠尾剪短,并增加消化时间。

(4)蛋白酶K保存不当导致活性降低或者失活

建议:更换新的蛋白酶K进行酶解反应。

(5)洗脱液添加不正确

建议:请使用在65℃预热的Buffer EB进行洗脱;如果使用dd水或其他洗脱液,确认洗脱液的pH值在7.0-8.5之间。

(6)洗脱液体积太少。

建议:请按说明书上要求的用量滴加洗脱液,最少不低于50ul。

2. 提取获得的基因组DNA产量低

可能存在的原因如下:

(1)组织样本保存不当或保存时间太长,导致基因组DNA已经降解。
建议:组织样本保存于液氮或者-70℃;尽量使用新近采集样本进行基因组DNA的提取。

(2)样本用量过少可能导致提取不到相应的基因组DNA。
建议:对于保存时间很长或基因组DNA降解比较严重的组织样本,可以适当增加组织样本的用量,以便提取获得满意的基因组DNA。可以根据DNA的需要来确定样本的用量,但是初始样本不宜超过50mg。

(3)样本用量过多,导致消化不完全,离心不彻底,上离心柱时可能堵塞纯化柱,提取获得的基因组DNA会较少
建议:根据组织的不同,用量在10-50mg内调整,如果出现消化不完全或者纯化柱堵塞,请减少相应组织用量。

(4)蛋白酶K保存不当导致活性降低或者失活
建议:更换新的蛋白酶K进行酶解反应。

(5)洗脱液添加不正确
建议:请使用在65℃预热的Buffer EB进行洗脱;如果使用dd水或其他洗脱液,确认洗脱液的pH值在7.0-8.5之间。

(6)洗脱液体积太少。
建议:请按说明书上要求的用量滴加洗脱液,最少不低于50ul。

3. 提取获得基因组DNA纯度低

基因组DNA纯度低会导致下游实验的失败或效果不理想,如:无法酶切,PCR得不到目的基因片段等.
可能存在的原因如下:
a. 消化不彻底或上清液加到纯化柱之前有细小沉淀导致的杂蛋白污染、RNA污染。
建议:尽量保证清液中无沉淀,必要的话可多舍弃些上清液;增加buffer PP洗涤次数。

b. 省略了Buffer GW洗涤纯化柱步骤导致残留的杂质离子污染。
建议:务必按说明书使用Buffer GW漂洗纯化柱,必要的话可以多漂洗一次,以尽量去除残留的离子。

c. Buffer GW漂洗纯化柱后,没有进行空管离心操作导致的乙醇残留。
建议:按说明书进行正确的空管离心操作。

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